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Sêmen fresco, resfriado ou congelado: existe diferença entre eles?

Autoria de Nayara Magalhães Gonçalves e Mariana Machado Neves, em 13/12/2011

A inseminação artificial – quando conduzida corretamente por um profissional, como o médico veterinário – pode trazer várias vantagens, como aumento do número de descendentes de um reprodutor e cruzamentos que modificam características de produção. Neste artigo as autoras explicam  como o material deve ser armazenado para obter os melhores resultados.

 

O homem tem modificado a maneira de criar os animais desde o início do processo de domesticação. As alterações ocorreram em diversos setores da pecuária, como nutrição, instalações, manejo sanitário, bem-estar animal, genética e reprodução. Os objetivos dessa evolução sempre foram atingir níveis elevados de produção de alimentos, tornar os sistemas mais eficientes e incrementar o ganho econômico. Com relação à reprodução animal, a inseminação artificial e outras técnicas a ela associadas vieram beneficiar o produtor, ao permitir melhorias do rebanho em um curto período de tempo e vantagens econômicas.

A inseminação artificial – quando conduzida corretamente por um profissional, como o médico veterinário – pode trazer várias vantagens, como aumento do número de descendentes de um reprodutor, cruzamentos que modificam características de produção, aceleramento da introdução de novos processos genéticos, aproveitamento do período fértil da fêmea, previsão e controle do momento do parto e redução do índice de doenças sexualmente transmissíveis. Entretanto, o método da inseminação apresenta algumas limitações, como a necessidade de mão-de-obra qualificada, assistência técnica periódica e equipamentos específicos (Hafez, 1995; Silva, 2008).
Nas espécies domésticas, a técnica começou no ano de 1779, por meio de investigações de Lazaro Spallanzani, que decidiu tentar fecundar artificialmente uma cadela com sêmen fresco de um macho normal. Ele teve sucesso, ao obter uma ninhada de cachorros normais. Apesar disso, a técnica da inseminação artificial só foi aplicada como método eficaz de reprodução no início do século XX (Silva, 2008).

Hoje, percebe-se a ampliação no uso da inseminação artificial, sendo aplicada até mesmo em animais silvestres, com o objetivo de manter ou aumentar a biodiversidade desses que sofreram e ainda sofrem ação antrópica (Paula, 2011). Porém, nesse contexto, deve-se levar em consideração o fato polêmico do uso eficiente da técnica nos animais selvagens em cativeiro, pois é necessário seu condicionamento, estudo da sua biologia reprodutiva e de aspectos endócrino-fisiológicos e comportamentais, evitando, assim, padrões de comportamento estereotipados (Bueno, 2008).

Os resultados e o sucesso da implantação da técnica da inseminação artificial dependem de muitos aspectos importantes. Dentre eles, podemos destacar a qualidade do sêmen utilizado e a via de inseminação, além do correto acompanhamento do ciclo reprodutivo para que ela ocorra no estro fértil, o qual corresponde ao período de ovulação (EMATER-MG, 2000; Silva et al., 2002).
Para se realizar a inseminação artificial, é possível utilizar o sêmen de três formas: fresco, resfriado ou congelado. Existem vantagens e desvantagens para cada método de processamento do ejaculado e cabe ao profissional responsável analisar os tipos que melhor atendem às exigências de cada caso (Magnago, 2000).

No caso do uso do sêmen fresco na inseminação artificial, pode-se ou não adicionar um meio denominado de diluente. Já no caso do sêmen resfriado e congelado, esta diluição é obrigatória. Os diluentes permitem o aumento do volume total do ejaculado, facilitando sua divisão em doses inseminantes e proporcionando um ambiente favorável para a sobrevivência dos espermatozóides in vitro. A composição química do diluente difere de acordo com a espécie animal, a procedência do sêmen e a tecnologia seminal empregada (Cavalcante, 2008). Os diluentes são formulados para propiciar suporte nutritivo aos espermatozóides, neutralizar alterações do pH consequentes da atividade metabólica, manter pressão osmótica, impedir crescimento bacteriano e proteger as células do choque térmico, durante o resfriamento e congelamento, limitando assim as lesões celulares (Magnago, 2000).

Sêmen fresco
A utilização do sêmen fresco na inseminação artificial é muito simples. Ele é o que oferece as melhores taxas de gestação, quando efetuada corretamente, porém, é o que apresenta menor flexibilidade quanto à sua utilização. Este tipo de sêmen pode ser utilizado em diferentes vias de inseminação, sendo a principal a intravaginal. O diluente utilizado pode ser o próprio líquido prostático. Caso o volume ou a concentração espermática não seja suficiente para a inseminação, pode-se realizar uma segunda coleta de sêmen para incrementar a amostra. Outra forma de aumentar o volume seria a adição de diluentes ao ejaculado (Silva et al., 2002).

O volume do ejaculado é muito variável entre as espécies e entre cada animal, uma vez que depende muitas vezes do tipo de coleta: por eletroejaculação, manipulação digital ou vagina artificial (Figura 1). Mas o reprodutor não deve fugir muito da média estabelecida para sua espécie (Tabela 1). É importante dizer que o que determina o valor biológico do sêmen não é o volume ejaculado, mas sim a quantidade de espermatozóides que ele pode conter (CBRA, 1998).

Outra característica que revela a qualidade do ejaculado é a sua coloração, que pode distinguir um sêmen mais concentrado que outro e indicar lesões ou patologias. Por exemplo, sêmen com coloração avermelhada é devido à presença de sangue, o que significa que o animal está com algum ferimento na uretra, glande ou glândulas anexas. Já a coloração esverdeada pode ser devido a secreções purulentas, que indicam alguma infecção (Teixeira, 2009). Na figura 2, pode se notar as diferenças de volume e coloração entre o ejaculado de diferentes animais.

 

 

Sêmen resfriado
A temperatura de manutenção do sêmen resfriado varia de 4º a 5ºC. Ele pode ser armazenado por um período de quatro a nove dias, o que permite um pouco mais de flexibilidade de uso quando comparado ao sêmen fresco. O tempo em que o sêmen deverá ser utilizado depende da qualidade espermática inicial, da temperatura de conservação e do diluente empregado (Silva et al., 2002; Severo, 2009). Esse procedimento reduz o crescimento microbiano, mantendo a viabilidade do sêmen diluído por mais tempo (Severo, 2009). Sêmen suíno resfriado a 15º e 18o C e armazenado por um período de até cinco dias atinge taxas de nascimento maiores que as comparadas, por exemplo, com sêmen congelado (Antunes, 2007).

O uso do sêmen resfriado mantém um número de espermatozóides viáveis por um período de tempo maior, se comparado ao fresco, e seu tempo de processamento é menor em relação ao congelado. Porém, a viabilidade espermática começa a diminuir após 72 horas de armazenamento, independentemente do diluente utilizado (Severo, 2009).
A refrigeração do material coletado pode ser feita utilizando isopor e gelo, geladeira, câmara ou máquina de resfriamento. A figura 3 mostra uma câmara de resfriamento, na qual os tubos contendo amostras de sêmen são refrigerados em temperatura controlada.

 


Sêmen congelado

É o que permite maior flexibilidade de uso, porém, é o que sofre as mudanças mais drásticas quanto à sua qualidade pós-descongelamento. O sêmen congelado vem sendo muito utilizado na espécie bovina e está em fase de aperfeiçoamento em outras espécies, como bubalinos, ovinos, caprinos, suínos, caninos e equinos, pois ainda é baixo o percentual de espermatozóides viáveis recuperados a 37ºC (Ohashi, 2002; Silva et al., 2002).
A diminuição da viabilidade espermática após o descongelamento se deve ao grande estresse térmico, mecânico, químico e osmótico que é imposto aos espermatozóides, especialmente à sua membrana plasmática, devido a uma reorganização de seus lipídios, além da formação de cristais de gelo intracelulares.

Se eles são congelados de maneira lenta, sofrem um dano por excessiva desidratação da célula. Se congelados muito rápido, os espermatozóides não perdem água suficiente, provocando a formação de cristais de gelo dentro dela, o que provoca danos irreversíveis. A taxa de congelamento deve, então, ser suficientemente lenta para permitir a saída de água de dentro da célula por osmose, prevenindo, assim, o gelo intracelular, e suficientemente rápida para minimizar os danos pela exposição prolongada a concentrações altas de solutos (Escobar, 2004).

Para que o sêmen congelado apresente uma capacidade fértil considerável quando reaquecido, é fundamental o uso de um bom diluente, o qual deve conter nutrientes que sirvam como fornecedores de energia e agentes tamponantes, além de ter uma concentração de eletrólitos dentro dos padrões fisiológicos. Além disso, no caso do sêmen congelado, é necessária a adição de agentes crioproteptores, que promovem uma proteção celular contra o congelamento (Escobar, 2004; Silva, 2005). Um espermatozóide móvel não significa necessariamente que ele tenha uma capacidade fértil. Para fecundar o ovócito, ele precisa apresentar atividade metabólica para a produção de energia, motilidade progressiva, acrossoma íntegro, repleto de enzimas que atuarão sobre a zona pelúcida e proteínas na membrana plasmática (Oliveira, 2007).

O tipo de envase é muito importante para se obter a qualidade do sêmen. Muitos laboratórios comerciais congelam o sêmen em palhetas de 0,5mL, porém existem também macrotubos de 4,0 ou 5,0mL e minipalhetas de 0,25mL (Figura 4A) (Lorenzone, 2010). Após a diluição, é realizado o envasamento do sêmen, dividindo-o em várias doses, para que sejam armazenados no botijão de nitrogênio líquido (Figura 4B) (Teixeira, 2009).

 

 

 

Ocorrido o envasamento, as palhetas são colocadas no local a em que será feito o resfriamento (Figura 5A), para que a temperatura do sêmen baixe gradualmente até atingir 5ºC. Essa etapa chega a durar cerca de 4 horas. Depois do resfriamento, é feito o congelamento, no qual as palhetas deverão passar da temperatura de resfriamento para a de aproximadamente 120ºC negativos, até serem completamente imersas no nitrogênio (Teixeira, 2009).

 

Para isso, as palhetas são colocadas em um suporte, dentro de um isopor contendo uma lâmina de nitrogênio, para que o alcance da temperatura (-120ºC) ocorra a partir da exposição do vapor de nitrogênio. Outra maneira de realizar o congelamento pode ser pelo uso da máquina de congelamento, em que se colocam as palhetas dentro de um porta-palhetas (Fig. 5B) conectadas à máquina e em contato com o nitrogênio. No caso, a própria máquina regula a curva de congelamento, antes de imergir completamente as palhetas no nitrogênio. Após esse procedimento, as palhetas são armazenadas dentro de canisters no botijão de sêmen (Figura 5C), e o restante de nitrogênio utilizado no congelamento pode retornar ao botijão (Figura 5D).

 

As vantagens desse tipo de técnica de preservação celular são diversas, como o uso de reprodutores em termos internacionais, o armazenamento do material genético por tempo indeterminado, guardando os devidos cuidados com o material coletado e conservado, e a utilização dos gametas de reprodutores que já vieram a óbito. Além do mais, os sêmens criopreservados estão sendo utilizados em Bancos de Germoplasma, como no Programa de Pesquisa em Recursos Genéticos da Embrapa, com intenções de restabelecer uma raça bovina extinta, desenvolver um novo grupamento genético e fornecer material para estudos moleculares visando à identificação de genes de importância econômica (Marianti et al., 2011).

Referências Bibliográficas
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Nayara Magalhães Gonçalves e Mariana Machado Neves são, respectivamente, aluna de graduação em Medicina Veterinária e professora de Histologia e Embriologia no Departamento de Biologia Geral da UFV